В реакциях используют компоненты, не обладающие антикомплементарными и гемотоксическими свойствами.
4.3.2. Последовательность постановки РДСК
Первый день.
Розлив испытуемых и контрольных сывороток для главного опыта и для титрования гемолитической системы.
Инактивирование сывороток.
Контроль компонентов реакции на антикомплементарность и гемотоксичность.
Розлив антигена и комплемента.
Приготовление гемолитической системы.
Помещение пробирок в холодильник.
Второй день.
Выдерживание пробирок главного опыта и гемолитической системы при комнатной температуре 20 минут.
Титрование гемолитической системы.
Определение рабочей дозы гемолитической системы.
Главный опыт.
Розлив гемолитической системы в пробирки с исследуемыми сыворотками.
Учет и оценка результатов реакции.
Испытуемые сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (контроль на антикомплементарность сыворотки), при массовом исследовании реакцию проводят в одной пробирке в разведении сыворотки 1:5 с антигеном (см. табл. 3). Одновременно разливают сыворотки для титрования гемолитической системы. Для этого позитивную овисную сыворотку, негативные сыворотки (2 серии), взятые из набора, и одну сыворотку, взятую из исследуемой партии, разводят 1:5 физиологическим раствором (1 мл сыворотки + 4 мл физиологического раствора). Инактивирование сывороток крови проводят как указано было в данном подпункте.
Комплемент применяют в рабочем разведении 1:20, 1:25 или 1:30 в зависимости от его титра. Если титр комплемента в гемосистеме не известен, перед постановкой реакции определяют его рабочее разведение согласно схеме по таблице 1.
Розлив компонентов и последовательность постановки реакции осуществляют по схеме, указанной в таблице 3.
Перед розливом гемолитической системы в пробирки с исследуемыми сыворотками проводят титрование гемолитической системы по схеме согласно таблице 2.
Контроли реакции:
негативные и позитивная овисная сыворотки в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена;
гемолитическая система без сыворотки, антигена и комплемента.
Титром гемолитической системы считают наибольшее ее количество, в котором произошел полный гемолиз в обоих рядах пробирок с негативными и испытуемой сыворотками и в безантигенном ряду с позитивной сывороткой. Рабочий титр на один интервал ниже (например: при титре гемолитической системы 0,6 мл, рабочий титр - 0,5 мл).
Примечание. Если в пробирках с испытуемой сывороткой и антигеном гемолиз будет отсутствовать, это означает, что для титрования гемсистемы была взята положительная сыворотка. В таких случаях при определении титра гемсистемы следует учитывать показания реакции в пробирках без антигена.
4.3.3. Учет результатов РДСК
Реакцию длительного связывания комплемента учитывают визуально. При постановке реакции в одной пробирке (при массовом исследовании) учет проводят один раз - сразу после извлечения штативов из водяной бани. При исследовании в трех пробирках - через 3 - 4 часа, когда в контрольных пробах с позитивной овисной сывороткой эритроциты осядут на дно пробирки, или на следующий день (в этом случае штативы с пробирками главного опыта оставляют в холодильнике).
Результаты реакции оценивают в крестах по следующей схеме:
++++
(4 креста)
-
отсутствие гемолиза, надосадочная жидкость прозрачная и бесцветная;
+++
(3 креста)
-
гемолиз 25% эритроцитов;
++
(2 креста)
-
гемолиз 50% эритроцитов;
+
(1 крест)
-
гемолиз 75% эритроцитов;
-
(минус)
-
полный гемолиз эритроцитов, осадок отсутствует, жидкость интенсивно окрашена гемоглобином.
4.3.4. Диагностическая оценка РДСК
При исследовании сывороток в одной пробирке (в разведении 1:5 с антигеном), все сыворотки, давшие задержку гемолиза в один крест и выше, исследуют повторно в тот же или на другой день в трех пробирках в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена.
Реакцию считают: положительной - при задержке гемолиза на 2 - 4 креста в одном или в двух разведениях сыворотки (1:5 или 1:10) и полном гемолизе эритроцитов в контрольной пробирке (без антигена); сомнительной - при задержке гемолиза с оценкой в один крест. При получении сомнительного результата сыворотки крови от животных через 15 - 30 дней исследуют повторно. При этом животных, с сывороткой крови которых получена дважды сомнительная РДСК, считают реагирующими положительно.
Суммарные результаты исследования испытуемых сывороток по каждой экспертизе, номера серий, сроки годности антигена, комплемента, гемолизина и их рабочие титры записывают в журнал серологических исследований.
В заключении лаборатории о результатах исследования сывороток крови животных указывают диагностическую оценку каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и показания реакции в крестах.
21 сен 2024
