AAV Purification 

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It is very interesting that in a video of less than 6 minutes, they teach us a technique for the purification of AVV. Seeing this process and being able to understand it makes learning easier, the fact of seeing how careful they are and the exact method required for its elaboration also shows us how complex a procedure like this can be. Now, ultracentrifugation could be said to be of the utmost importance for the production and purification of the AAV vector that is released from the solution found in the cell culture. It is necessary to highlight this method that is presented to us in the video, it provides us with information to know and better understand separation techniques, in this case with the use of a column with 4 different densities, so that the particles remain in one of the these 4 zones, depending on their density and/or size, which is very interesting to appreciate.

La ultracentrifugación en gradiente de densidad brinda el mecanismo para aislar los diferentes compuestos virales de interés en distintas columnas de acuerdo a sus densidades. Además, es un plus que cada capa presente una coloración distinta, por lo que podríamos relacionar el color de la capa con el componente que se necesite. A la hora de preparar la columna con iodixonal, cada capa se agrega lentamente una sobre la otra, con la capa de mayor densidad en la parte inferior y las capas de menor densidad se irán agregando posteriormente en la parte superior hasta cargar el sobrenadante al final. Cuando finaliza el recorrido de los compuestos virales y todos se encuentran en la capa a la cual su gravedad permite, podemos hacer la extracción del líquido que contiene nuestras muestras de interés con ayuda de agujas especiales. Resulta un proceso bastante sencillo, limpio y rápido para extraer AAV. Genial.

La ultracentrifugación es una parte imprescindible para la producción y purificación del vector AAV liberado de la solución de cultivo celular. Los virus centrifugados en gradiente de soluciones de iodixanol son separados dependiendo de su tamaño y densidad, lo que permite colectarlos selectivamente. Siendo un método sencillo, pero que requiere mucho cuidado a la hora de realizarlo, debido a que no se deben mezclar las capas con las diferentes densidades de iodixanol y evitar las burbujas de aire para que la columna no colapse en las condiciones de vacío de la ultracentrífuga. Algo de gran importancia es que tiene la capacidad de separar partículas virales vacías de la completas. Además esta técnica permite desunir orgánulos, proteínas, ácidos nucleicos y recuperar gran cantidad de partículas virales con alto grado de pureza. ¡Muy buen video!

Sorprendentemente, en un vídeo tan breve, nos enseñan una técnica de purificación AVV. El hecho de que ver el proceso y poder entenderlo nos permita aprender, ver lo cuidadosos que son y los procedimientos precisos que se requieren para preparar el proceso también nos muestra cuán complejo puede llegar a ser un enfoque de este tipo. Es increíble cómo el proceso de purificación para obtener el vector AVV es muy cuidadoso y utiliza partes precisas de los reactivos y los materiales específicos para realizar este proceso, donde la capacidad de la ultracentrífuga para separar estas moléculas en capas con el tiempo, considerando para reducir el calor y la fricción generados, necesita ser girado en el vacío. Esto también nos da información para comprender mejor y entender la técnica de segmentación, en este caso usando columnas con 4 densidades diferentes para mantener las partículas en una sola. Muy buen video

Es muy sorprendente todo lo que se observa en el vídeo, mirar el paso a paso que requiere la purificación del AVV, desde esos colores que representan las distintas concentraciones del reactivo, hasta la ultracentrifugacion que permite separar estás moléculas en un determinado tiempo. El papel que cumple la centrífuga es lo que más resalto de todo, ya que es muy importante en este proceso, haciendo la separación en componentes más densos y menos densos permitiendo así que el resultado final sea exitoso . Excelente video.

Muy buena explicación de la carga y descarga de la columna iodixanol, este método permite un extracción más limpia y eficiente del vector AVV. Gracias a la ultracentrifugación permite que la fuerza de rotación experimentada en la solución de paso a la purificación de AVV que cambia de concentración liberándose de su cultivo celular, obteniendo de manera asilada las partículas en función de su tamaño y densidad.

Me parece muy interesante el video, ya que se hace necesario conocer la purificación de AVV por medio de la separación de partículas virales. Esto nos proporciona buen conocimiento para llevar a cabo separaciones las cuales se hacen con la utilización de una columna que tiene 4 densidades. Entonces se puede observar que las partículas se separan por centrifugación y, dependiendo su tamaño y densidad, quedan en alguna de las cuatro densidades de la columna. Y es realmente impresionante lo que se puede apreciar ya que después se pincha con una aguja la última columna que es la que tiene los ácidos nucleicos. Puedo concluir diciendo que realmente es emocionante y además nos permite aprender de como se puede llevar a cabo el proceso la purificación de AVV.

It was a good video where we can appreciate a particular procedure of separation of viral material. I never had seen the way how scientists do that. Viruses are incredible things. I am really into them and hope make any research about them anytime.That's why to me is important to recall every step in this procedure. The main thing we have to remember here is being careful, that is what can asure us a succeful end, and of course follow every single step accurately. My opinion? fantastic, we should make a practice like this in our college. :3 I didn't describe the procedure cuz everything is in the video, I only wanted to share what's on my thoughts.

Es impresionante como los colores nos dan un carácter cualitativo, mostrando cada una de las distintas concentraciones del reactivo en cuestión. Dándonos a entender una técnica, que hasta las personas que no se muevan dentro de este campo podrían entender fácilmente lo que se está haciendo. Además, de que se parte de una premisa, la cual se basa en las características de las moléculas y partículas (como la densidad y el tamaño). Esto nos dice de forma anticipada el resultado final del procedimiento, si éste es realizado correctamente. También quedó clara la capacidad de la ultracentrífuga para separar estas moléculas por capas en un tiempo determinado, teniendo en cuenta que para reducir el calor generado y la fricción, es necesario girar en vacío. Destaco y aprecio los consejos que nos brindan para ejercer la técnica de forma efectiva, y no tener problemas, como lo son el tener cuidado al presionar la jeringa, efectuando esta acción con una presión lenta y uniforme, teniendo cuidado de no mezclar las soluciones; también al rellenar y sellar la columna con PBS se deben evitar las burbujas de aire, ya que pueden hacer que la columna colapse en las condiciones de vacío de la ultracentrífuga; además se debe tener cuidado al recolectar la capa amarilla del 60%, porque contiene la mayor parte del reactivo que se debe eliminar posteriormente; entre otros consejos mencionados. Muchas gracias, ¡excelente video!

Es muy interesante ver la poca cantidad de pasos que requiere la purificación del AVV, algo para resaltar es la colocación de soluciones para la centrífugacíon, además de que el sellado para la centrífugacíon al vacío no lo había dislumbrado y entrega una mecánica un tanto más homogénea además que al estar lleno de líquidos de diferentes densidades ayuda a separar en cada capa de densidad las organelos, las proteínas, los ácidos nucleicos y el AVV. Es una manera bastante limpia de separación y a la vez bastante sencilla para su replicación.

Beautiful technique

You fureekin ROCK!!!! Yeah!!!!!

Es impresionante como el proceso para obtener la purificación del vector AVV es de sumo cuidado y con cantidades exactas de los reactivos asi como de los materiales específicos para llevar este proceso acabo, sin embargo, es de resaltar como la centrifuga cumple un papel muy importante en dicho proceso, el como empieza a separar una muestra en sus componentes más densos y menos densos respectivamente es la clave de que la extracción del vector AVV resulte exitosa, si no fuera por este paso sería casi que imposible separar de una manera casi perfecta estos componentes para asi obtener la muestra deseada, siempre y cuando se le coloquen las medidas correctas, que en este caso fueron 350 mil g durante 90 minutos, aqui es donde podemos notar la importancia que tiene la fuerza centrifuga, ya que debido a esto las capas individuales permanecen intactas mientras que las macromoléculas del sobrenadante quedan en la parte superior y así poder extraer la muestra deseada. Todo esto nos puede llegar a recordar una definición de la fuerza centrifuga, la cual dice que: La fuerza centrífuga es la fuerza aparente que experimenta un cuerpo en un sistema de referencia rotatorio. Que está dada por la ecuación: fuerza centrífuga = − ω m (ω × r) = m ω2 r, aquí podemos ver como la física, la química, la biología y la ciencia en general se complementa y cada una de ellas es tan importante como la otra, si no fuera por el conocimiento que se tiene sobre la fuerza centrifuga, no fuera posible usar un centrifugador y en este caso obtener una correcta purificación del vector AVV.

That's a cool video.

Es muy interesante saber acerca de la producción de AAV donde por medio de a centrifugación de manera muy pura se libera una solución de cultivo celular La base para una buena técnica es la ultra centrifugación en gradiente de densidad isopicnica, donde se aíslan las partículas virales dependiendo de tamaño y densida. Donde el sellado juegan un papel muy importante para lograr un vacio. Para lograr de una forma muy homogénea los liquidos, en diferentes densidades y capas, apreciar mejor las organelas, proteínas, el AVV Es una manera muy buena e interesante para una sepacion cada vez mas salen cosas mas imnovadoras para lograr mejores experimentos

Hi! Thanks a lot for the video! Could you please tell what exact needle do you use to fill the centrifuge tube from the bottom?

This is a procedure where we're studying a few steps of the Adeno associated virus vector (AAV) production. The main features of these steps are related to use a composed called "iodixanol" and a process called "ultracentrifugation" to form some column density gradients to help purify a cell culture solution. The basis of the technique is isolate virus particle according to its size and density. We have to prepare a column with 4 densities of iodixanol, adding each layer at a time. After that, we add the virus containning supernatant to the top carefully. Then, we spin in the ultracentrifuge. This process will separate nucleic acids, organelles, proteins and AAV according to the different density gradients in the corresponding layer of iodixanol. The AAV will be found at the bottom, so we have to puncture in the bottom layer with a needle to extract drop by drop the solution of AAV that we will need for the rest of the process. Great video. I love it.

real eye opener

El vídeo muestra de forma general un método para obtener soluciones de vector de alta calidad (purificadas) para su análisis a partir de una columna con 4 densidades diferentes de iodixanol (en diferentes porcentajes) que se someterá a una ultracentrifugación a 350,000 G durante 90 min. Con el fin de que las macromoléculas migren hasta que la densidad de estas y las del gradiente sean idénticas. Justamente el AAV entrará a la capa iodixanol al 40%. Finalmente, el AAV que se encuentre en la penúltima capa será extraído por una aguja y el contenido será almecenado en unos tubos de Eppendorf para su análisis ¿Extricatemente se debe rellenar la columna con PBS? porque creo que con agua destilada también se puede hacer para que la columna no colapse.

Good video. However, certain things are missing: 1. Clear indication of the size of the first fractions that are "the best"; 2. The method for determining the fraction volume while collecting the fractions; 3. Clear indication of the criteria for a "good" fraction. It appears that the authors defer it to a novice user to decide on the acceptable level of contaminants. This "advice" is not going to help the rigor and reproducibility.