Dos cosas importantes: * En Cuantificación Absoluta, los puntos en los cuales las curvas tocan el umbral (llamados "ciclos umbral" o "Ct") son los puntos que tomaremos para la realización de nuestra curva estándar. * En cuantificación relativa, solo expliqué lo que es un "ΔCt"; que es la comparación de un gen de interés con un housekeeping o cualquier otro. Básicamente, la diferencia numérica de los diferentes Cts de estos genes. Sin embargo, el método de "ΔΔCt" que muestro sirve para comparar esta diferencia, con la diferencia de estos mismos genes encontrada en animales, tejidos o células que sufrieron una condición experimental diferente. De esta manera, es posible saber que tanto se subexpresa o sobreexpresa un gen particular cuando sufre una condición determinada (e.g. expresión del gen "A" en células CHO cuando son cultivadas en presencia o ausencia de un fármaco).
Hola, sinceramente quisiera tu ayuda para entender mejor como determinar la sub o sobre expresion de un gen con el ΔΔCt porque por más que lo intento no le entiendo, jejeje muchas gracias.
Ante todo, muchísimas gracias: jamás encontraré nada de esto mejor explicado. Me gustaría que hicieras un video sobre la PCR multiplex. Saludos desde Cuba
Excelente video, muy didáctico al exponer los conceptos básicos para la comprensión del tema. Actualmente laboro como asistente en un pequeño laboratorio de genética en el cual tenemos un termociclador de tiempo real, sin embargo por cuestiones de falta de financiación no se había podido comprar los reactivos y consumibles. Lastimosamente la llegada de estos coincidió con la pandemia lo que llevó a cancelar toda actividad presencial en el laboratorio pues es de docencia. Llevo algún rato buscando información del tema ya que deseo profundizar en él pero la mayoría es muy superficial, me siento un poco apenado por hacer esta petición por este medio pero podría por favor compartir más información o señalarme algún protocolo práctico para la determinación de las curvas de calibración de las mediciones (absoluta y relativa). Finalmente si no es mucho atrevimiento y si tiene disponibilidad de explicar el manejo de esto en el software de un termociclador de tiempo real.
Hola Neftali! con mucho gusto puedo ayudarte compartiendo manuales y más información que pudiera enriquecer tu conocimiento sobre la PCR en tiempo real. Siempre es un placer compartir información. Sobre la asesoría para explicar el software del termociclador, realmente no creo que sea la mejor persona para explicarlo. Todas las compañías tienen diferentes softwares que pueden tener ciertas similitudes, pero son diferentes al final de cuentas. ¿Qué termociclador compraron? Ahí, siento que la compañía debería darles a ustedes la asesoría como parte de su compra. No tiene chiste que vendan equipos, si no pueden enseñarle a sus clientes el como usarlos. Si gustas, siéntete libre de contactarme en mi mail.
@@neftaliricardoalarconquiro5016 Claro que si: brandonortizc@gmail.com De momento estaré muy ocupado, pero cuando terminen mis actividades, con gusto lo checamos.
Hola Jazmin. La principal diferencia yace en que una PCR convencional solamente te amplifica el ADN, y para poder verlo, debes utilizar un segundo paso (casi siempre, deberás revelarlo en un gel de agarosa con algún fluoróforo) En contraste, la qPCR al momento de amplificar, va generando una señal fluoresente debido a los insumos que metiste a la reacción. Al terminar la PCR, ya tienes tus curvas que son tus resultados, y no hay necesidad de pasar por un gel de agarosa. Además, la señal fluoresente se puede cuantificar, por lo que es una metodología que permite calcular concentraciones de ADN iniciales.
A mi siempre me encanto la quimica, pero la cantidad de matematicas que usan es absurda, bien podria se una rama de la fisica, por eso soy taquero :P, exelente video!
Hola Manuela. Cuando hablamos de "RT-PCR", no solemos hablar de tiempo real, sino de transcriptasa inversa. Para tiempo real, solemos decir "qPCR" por "quantitative PCR".
Podría hablar da la cinética de la curva, el punto de corte, los Ct, qué es el slope y su valor correcto, el intercept y el R2 en una curva st. Gracias.
Hola nuevamente. Si me gustaría hacer un video mucho más analítico sobre PCR. Solo que ya tengo muchas deudas con la sociedad sobre otros temas que debo de abordar.
Que tal Brandon? Muy buen vídeo! Lo entendí todo genial, pero tengo una pregunta. Si tenemos una grafica con tres curvas de tres reacciones diferentes y nos dan: los ct de las tres, n0 de una de ellas y nada más. ¿Cómo podría calcular n0 de las otras dos? ¿Una simple regla de 3?
Hola Carmen. En dado caso, aunque técnicamente podrías hacer una regla de 3 (si le asignas un valor a la eficiecnia), estrictamente hablando no podrías calcular nada de verdadero valor. El propósito de la curva estandar es poder interpolar con precisión, y evitar justamente eso.
Algo que no entiendo nada es que si partimos de una dilación con 10 copias de algo; que no se supone que en el ct 19 a fuerzas debo de ver algo, que en ese tiempo ya tendré 2 elevado n donde n= al número de ciclos y por lo tanto no importa que tenga una muestra con pocas copias porque después de todo estamos teniendo miles de copias. Perdón pero me da pena preguntar a mi jefe, me va a matar😭
Hola Andrea. No necesariamente. De hecho, ojala estandarizar una PCR fuera tan fácil como la teoría, ya que hay muchos puntos por los cuales no logramos amplificar (incluso a concentraciones mayores de DNA). No se que cantidad de suposiciones estás infiriendo, pero te puedo dar una decena de casos por lo cual no necesariamente tendríamos amplificación pasando el umbral. En primera instancia, no siempre lograremos tener un comportamiento 2^n. Por lo general, obtendremos algo menor. Una buena eficiencia sería mayor a 90% (por lo que requieres una pendiente por ahí entre −3.3 y −3.6) pero a veces suele ser mucho menor. Y para que esta no sea tan buena, pueden existir muchos factores. Quizá hay algo dentro de la muestra que está inhibiendo la reacción (por eso siempre hay que medir con el espectofotómetro, aunque esto no siempre ayuda si la matriz al momento de la extracción fue demasiado compleja). Quizá el diseño de tus sondas no es tan bueno, o estás intentando generar fragmentos muy largos. Quizás las condiciones propuestas de temperatura no son las más óptimas. Quizá uno no hizo tan bien las diluciones de los estándares. Quizá uno intenta detectar algo tan puntual como un SNP, pero en vez de sondas usa SYBR Green. O inclusive, quizá es momento de checar que tan bueno es uno pipeteando. Estos son solo algunos casos, y si hablamos de variedades de qPCR más complejas, ni hablar... Si tienes poco DNA y una mala eficiencia, es una pésima combinación que difícilmente pasará de los 20 ciclos para convertirse en algo analíticamente valioso.
Brandon Ortiz Casas Peal ente lo que estoy haciendo es una RT-QPCR y en teoría son regiones sintéticas y sabemos perfectamente que partimos de un número conocido de copias. 😭
@@Andrea-sh9sn ok, tal parece que tendrás que hacer un gran troubleshooting para encontrar el problema. Desconozco un tanto la naturaleza de tus experimentos, por lo que no puedo hacerme mucha idea de dónde pudieras tener problemas.
"2n" indica un crecimiento exponencial perfecto, donde todas y cada una de las copias de DNA se amplifica y crea otras 2 copias. Sin embargo, esto no siempre pasa en la vida real por varias razones: Dimerización de primers, inhibición de la reacción, mayor relación entre amplicones y polimerasas, etc. Todo esto hace que nuestra eficiencia no pueda ser perfecta (especialmente en los últimos ciclos). Por lo que debemos calcular una eficiencia "real" usando estándares bien conocidos. ¡Saludos!
Muchas gracias por todas tus respuestas. Tengo otra pregunta. Hoy monte un ensayo en un ABI FAST 7500 y el kit tiene 3 targets en un multiplex. Cuando haces tu ensayo eliges todos los detectores, etc. En los resultados sales los 3 targets para cada muestra y sus respectivos Ct pero, no se ve especificado el DETECTOR. Está: well/Sample name/task/ Ct/Quantity/; pero falta la columna de DETECTOR. Yo esperaba ver los 3 detectores que puse para cada gen. Gen1:FAM, Gen2:Texas red y Control interno:VIC. Para los resultados quería ver cada detector; sin embargo faltó esa columna que normalmente siempre se ve; pero las graficaras se ven bien y para cada muestra tengo sus Ct; pero qué habrá pasado? Será cuestión de software que no salió esa columna o hice algo mal. Perdón que pregunte tanto pero yo no soy experta en esto, y lo estoy haciendo por la emergencia. Nadie me explica nada, después de la pandemia me pagaré un curso. Mientras tengo problemas con el equipo, no en la parte de hacer los ensayos; pero quisiera entender más y no trabajar como 🤖 Gracias.
Hola de nuevo Andrea. Aquí ya está más compleja tu pregunta, ya que me hablas más del interfaz que de otra cosa. Aunque he estado en laboratorios con ABI FASTs, nunca he tocado uno (conozco el Step One del cual se, su interfaz es parecida. Por lo que intento darme una idea) pero en ese nunca multiplexee nada y solo usé un único filtro para los experimentos. Pregunta tonta. ¿ya te aseguraste que en tu equipo TODOS los dyes que usas para tu prueba multiplex ya están calibrados? Yo creeria que si. Pero checa, ya que tuve una situación parecida con el Step One hace algunos años. Por más que quisiera ayudar, no tengo ese nivel de expertiz. Sin embargo, ¿Ya trataste de hablar con algún representante de Thermo? Ellos muy seguramente pueden darte una orientación mejor sobre sus equipos. Tengo la tarjeta de algunos representates, y tambien tengo conocidos ahí, por si te llegara a servir. ¡Y ánimo! Todos debemos conocer de cabo a rabo nuestros equipos. Toma tiempo pero al final, lo vale. Me alegra que tengas tanto interés en racionalizar y no en mecanizar.
Brandon Ortiz Casas Gracias. Sí, está el equipo calibrado y todos los los detectores se encuentran listos para elegir. Hasta ahorita no me había pasado que no puedo ver en los resultados la columnas del DETECTOR; lo curiosos es que en la gráfica puedo ver perfectamente los colores asignados para cada Target. Mi problema es que estoy ayudando en la parte del PCR y las extracciones del material genético pero nadie me ha enseñado a usar el equipo de tiempo real. He aprendido viendo y los que importa son los resultados; pero esta vez me llamo eso la atención. Después de esta pandemia, voy a pagar,e un curso en Applied Biosystem; pero ahora no puedo. Espero que sea un problema del software ya que todos los equipos fueron calibrados por la pandemia en abril. Y hay otros muy modernos en donde dura la calibración por años. Este ya es un modelo viejo. Te agradezco mucho tu ayuda.
Que tal Brandon, una consulta de donde Obtienes N inicial o sub-cero en el caso de la muestra? (agradezco tu respuesta en caso que recién estoy aprendiendo
Hola Alejandra. Como tal, "No" es la única variable que nosotros debemos calcular, ya que la máquina y el procesamiento de datos nos da el resto de las variables al correr la PCR. La "N" nos lo da la cantidad de fluorescencia con base en los estándares, el no. de ciclos lo decidimos nosotros, y la eficiencia la calculamos de nuestra curva estándar. Por lo que simplemente debemos despejar la fórmula. Es muy simple! "No" es lo que siempre buscamos calcular con qPCR. Por ejemplo, esta variable nos indicaría el número de copias virales que tiene un paciente en su muestra (carga viral).
@@BrandonOrtizCasas Gracias por la respuesta, N entonces la arroja el equipo. La rectificación de la curva se realiza por regresión lineal? o una vez que vas uniendo los puntos se rectifica?
Hola Farko. Ese es otro tipo de PCR (Proteína C reactiva) que es muy diferente a lo que enseñé en este vídeo. Naturalmente, no te puedo dar la atención que te da un médico, pero puedo intentar explicártelo. Existe una molécula que produce tu cuerpo que se llama "Proteína C Reactiva". Cuando esta proteína la encuentras en altas cantidades en tu sangre, es por que estás teniendo una respuesta inflamatoria. Mayoritariamente, es un indicador que te dice que tienes inflamación por que hay un agente infeccioso. La VSG es una prueba que te dice que tan rápido se "decantan" tus células sanguineas (osea, que tan rápido se van al fondo de un tubo). Una VSG alta por lo general, también es un indicador de inflamación o infección.
@@BrandonOrtizCasas muchas gracias por tomarse el tiempo de contestar, con la explicación entendí un poco del proceso ahora buscaré videos para saber al cien.
Una consulta yo primera vez que escucho esta sigla pcr... Pero veo el video y quedo peor no entiendo nada lo escuche en una noticia quería saber que era pcr pero veo el video y no tengo idea me gustaría que me explicara pero no con esas palabras que para mis oídos suenan en chino por fis no quiero quedar como ignorante plis
